人III型原膠原N端前肽（PIIINP） 試劑盒（ELISA）
使用說(shuō)明書(shū)
? 本試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人
III型原膠原N端前肽（PIIINP） 的含量。
? 有效期： 6個(gè)月
? 保存條件： 2-8℃
? 本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷
實(shí)驗(yàn)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。 往預(yù)先包被人III型原膠原N
端前肽（PIIINP） 捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、 HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)
過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色， TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用
下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人III型原膠原N端前肽（PIIINP） 呈正相關(guān)。
用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。
樣本處理及要求
1. 血清： 將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000× g離心20
分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿： 用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000
× g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿： 用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞
會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組
織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000× g離心5~10分鐘，
取上清檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本： 請(qǐng)1000× g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯?br />于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
需要而未提供的試劑和器材
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭： 0.5-10uL、 2-20uL、 20-200uL、 200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
4. 蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
| 名稱 | 96 孔配置 | 48 孔配置 | 備注 |
| 微孔酶標(biāo)板 | 12 孔×8 條 | 12 孔×4 條 | 無(wú) |
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.3mL*6 管 | 0.3mL*6 管 | 無(wú) |
| 樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 檢測(cè)抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
| 20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋 |
| 底物 A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 底物 B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 封板膜 | 2 張 | 2 張 | 無(wú) |
| 說(shuō)明書(shū) | 1 份 | 1 份 | 無(wú) |
| 自封袋 | 1 個(gè) | 1 個(gè) | 無(wú) |
備注：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為： 64、 32、 16、 8、 4、 2 ng/mL
2. 經(jīng)過(guò)大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中
直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過(guò)最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本
進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室
溫 20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中
不要讓微孔干燥掉。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。
4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。泉州市九邦生物科技有限公司 產(chǎn)品縮寫(xiě)： PIIINP
3
5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞
試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。
10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1： 20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL；
3. 樣本孔中加入待測(cè)樣本 50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（ HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體
100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔， 37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙
上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物 A、 B 各 50μL， 37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入終止液 50μL， 15min 內(nèi)，在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)， 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪
制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程， 將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1. 檢測(cè)范圍： 2 ng/mL – 64 ng/mL。
2. 靈敏度：最低檢測(cè)濃度小于 0.1 ng/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。泉州市九邦生物科技有限公司 產(chǎn)品縮寫(xiě)： PIIINP
4
4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ， 板間變異系數(shù)小于 15% 。
說(shuō)明
由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分
析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
1. 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)
務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
2. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)
試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考。
3. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有
嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。
4. 本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使
用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
5. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致
ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。
6. 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)
間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。
7. 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)
抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。
